Search for a command to run...
(Kommissionens forordning (EF) nr. 900/2008 af 16. september 2008 om fastlæggelse af de analysemetoder og andre bestemmelser af teknisk art, der skal anvendes i forbindelse med importordningen for visse varer fremstillet af landbrugsprodukter (kodificeret udgave))
►M2 I overensstemmelse med definitionerne i fodnote 1, 2 og 3 i bilag III til forordning (EU) nr. 514/2011 og i fodnote 1, 2 og 3 i III. del, afsnit I, bilag 1, tabel 1, i bilag I til forordning (EØF) nr. 2658/87 vedrørende indholdet af mælkeprotein, indholdet af stivelse/glucose og indholdet af saccharose/invertsukker/isoglucose benyttes følgende formler, procedurer og metoder
a) ved anvendelsen af bilag II og III til forordning (EU) nr. 514/2011
b) til bestemmelse af mælkefedtindholdet, mælkeproteinindholdet, indholdet af stivelse/glukose og indholdet af saccharose/invertsukker/isoglukose med det formål at vælge det rette landbrugselement, de rette tillægstoldsatser for sukker og de rette tillægstoldsatser for mel for så vidt angår ikke-præferenceimport som fastsat i II. del og i III. del, afsnit I, bilag 1, i bilag I til forordning (EØF) nr. 2658/87: ◄
(udtrykt som 100 % vandfri stivelse i varer, som de forefindes)
a) (Z – F) × 0,9
når glucoseindholdet ikke er mindre end fructoseindholdet, eller
b) (Z – G) × 0,9
når glucoseindholdet er mindre end fructoseindholdet
hvor:
Z = glucoseindhold bestemt efter metoden beskrevet i bilag I til nærværende forordning
F = fructoseindhold bestemt ved HPLC (højtryksvæskekromatografi)
G = glucoseindhold bestemt ved HPLC.
I tilfælde litra a) gælder det, at såfremt der er påvist tilstedeværelse af lactosehydrolysat og/eller mængder af lactose og galactose, trækkes et glucoseindhold svarende til galactoseindholdet (bestemt ved HPLC) fra glucoseindholdet (Z), før der foretages nogen anden beregning.
(udtrykt som saccharose i varer, som de forefindes)
a) S + (2F) × 0,95
når glucoseindholdet ikke er mindre end fructoseindholdet
b) S + (G + F) × 0,95
når glucoseindholdet er mindre end fructoseindholdet
hvor:
S = saccharoseindhold bestemt ved HPLC
F = fructoseindhold bestemt ved HPLC
G = glucoseindhold bestemt ved HPLC.
Såfremt der er påvist tilstedeværelse af lactosehydrolysat og/eller mængder af lactose og galactose, trækkes et glucoseindhold svarende til galactoseindholdet (bestemt ved HPLC) fra glucoseindholdet (G), før der foretages nogen anden beregning.
a) Med forbehold af bestemmelserne i litra b) eller c) bestemmes indholdet af mælkefedt i vægtprocent ved ekstraktion med petroleumether efter hydrolyse med saltsyre.
b) Såfremt der i varen også påvises andre fedtstoffer end mælkefedt, anvendes følgende procedure:
— det totale fedtindhold i vægtprocent i varen bestemmes som beskrevet i litra a)
— til bestemmelse af mælkefedtindholdet anvendes en metode med ekstraktion med petroleumether efter hydrolyse med saltsyre efterfulgt af gaskromatografi af methylestere af fedtsyre. Dersom der påvises mælkefedt, beregnes indholdet deraf i vægtprocent ved at gange indholdet af methylbutyrat i vægtprocent med 25 og gange det således opnåede resultat med det samlede fedtindhold i vægtprocent i varen og dividere med 100.
c) Såfremt andre fedtstoffer end mælkefedt også angives i sammensætningen af varer, der er pålagt en landbrugskomponent som fastlagt i del II og i del III, afsnit I, bilag 1, i den kombinerede varenomenklatur fastsat i bilag I til forordning (EØF) nr. 2658/87, og indeholder mindst 30 % mælkeprotein, bestemt i overensstemmelse med nr. 4 i denne artikel, og har et mælkefedtindhold på mindre end 6 %, som angivet af klarereren, anvendes følgende procedure i stedet for den procedure, der er fastsat i litra b):
— Det totale fedtindhold i vægtprocent i varen bestemmes som beskrevet i litra a)
— til bestemmelse af mælkefedtindholdet anvendes en metode med ekstraktion med petroleumether efter hydrolyse med saltsyre efterfulgt af gaskromatografi af methylestere af fedtsyre. Dersom der påvises mælkefedt, beregnes indholdet deraf i vægtprocent ved at gange indholdet af methylbutyrat i vægtprocent med 50 og gange det således opnåede resultat med det samlede fedtindhold i vægtprocent i varen og dividere med 100.
a) Med forbehold af bestemmelserne i litra b) beregnes indholdet af mælkeproteiner i varen ved at gange kvælstofindholdet (bestemt ved Kjeldahl-metoden) med faktoren 6,38.
b) Såfremt der i varen også konstateres bestanddele indeholdende andre proteiner end mælkeproteiner:
— bestemmes det samlede kvælstofindhold (i vægtprocent) ved Kjeldahl-metoden
— beregnes indholdet af mælkeproteiner som beskrevet i litra a), idet der fra det samlede kvælstofindhold i vægtprocent trækkes kvælstofindholdet svarende til ikke-mælkeproteinerne.
►M2 Ved anvendelse af bilag I til forordning (EU) nr. 514/2011 og bilag I til forordning (EØF) nr. 2658/87 benyttes følgende metoder og procedurer til tarifering af følgende varer: ◄
Ved tarifering af varer henhørende under KN-kode 0403 10 51 til 0403 10 59 , 0403 10 91 til 0403 10 99 , 0403 90 71 til 0403 90 79 og 0403 90 91 til 0403 90 99 bestemmes mælkefedtindholdet den i artikel 2, nr. 3), beskrevne metode.
Ved tarifering af varer henhørende under KN-kode 1704 10 10 , 1704 10 90 og 1905 20 10 til 1905 20 90 bestemmes saccharose, herunder invertsukker beregnet som saccharose, efter en HPLC-metode. Ved invertsukker beregnet som saccharose forstås den aritmetiske sum af lige mængder fructose og glucose ganget med 0,95.
Ved tarifering af varer henhørende under KN-kode 1806 10 15 til 1806 10 90 bestemmes indholdet af saccharose/invertsukker/isoglucose efter de i artikel 2, nr. 2), i nærværende forordning anførte formler, metoder og procedurer.
Ved tarifering af varer henhørende under KN-kode 3505 20 10 til 3505 20 90 bestemmes indholdet af stivelse, dekstrin eller anden modificeret stivelse efter den i bilag II til nærværende forordning beskrevne metode.
Ved tarifering af varer henhørende under KN-kode 3809 10 10 til 3809 10 90 bestemmes indholdet af stivelsesprodukter efter den i bilag II til nærværende forordning beskrevne metode.
Ved tarifering af varer henhørende under KN-kode 1901 90 11 og 1901 90 19 foretages afgrænsningen mellem de to koder på grundlag af tørstofindholdet bestemt ved tørring ved en temperatur på 103 °C ± 2 °C indtil konstant vægt.
Ved tarifering af varer henhørende under KN-kode 1902 19 10 og 1902 19 90 bestemmes indholdet af mel af blød hvede i pastaprodukter efter den i bilag III til nærværende forordning anførte metode.
Indholdet af mannitol og D-glucitol (sorbitol) i varer henhørende under KN-kode 2905 44 11 til 2905 44 99 og 3824 60 11 til 3824 60 99 bestemmes ved HPLC.
1. Der udarbejdes en analyserapport.
2. Analyserapporten skal indeholde følgende oplysninger:
— enhver information, der er nødvendig for identifikation af prøven
— den anvendte fællesskabsmetode og nøjagtig henvisning til den retsakt, hvori den er anført, eller i givet fald henvisning til en detaljeret metode, der specificerer de analyseoperationer, der skal udføres, eller princippet for en metode, der skal anvendes, som angivet i denne forordning
— enhver faktor, som kan tænkes at have haft indvirkning på resultaterne
— analyseresultaterne under hensyntagen til den måde, de er udtrykt på i den anvendte metode, og de udtryk, der dikteres af behovet hos de told- eller administrative myndigheder, som har anmodet om analysen.
1. Medlemsstaterne indsender senest den 17. december 2017 oplysninger til Kommissionen om resultaterne af analyser udført i overensstemmelse med procedurerne fastlagt i artikel 2, nr. 3) og 4), i forbindelse med varer med et mælkeproteinindhold på mindst 30 % som fastlagt i overensstemmelse med artikel 2, nr. 4), og angivet til toldmyndighederne mellem den 17. juni 2015 og den 17. juni 2017.
2. Oplysningerne omhandlet i stk. 1 indsendes i elektronisk form og består af:
a) datoen for antagelse af toldangivelsen
b) mængden af de berørte varer
c) tariferingen af de berørte varer
d) den angivne tillægskode og for varer, for hvilke analysemetoden fastsat i artikel 2, nr. 3, litra c), er anvendt, den tillægskode, der skal anvendes på baggrund af metodens resultater
e) mælkeproteinindholdet som fastsat ved analysemetoden nævnt i artikel 2, nr. 4)
f) angivelse af analysemetoden anvendt til at fastsætte mælkefedtindholdet i overensstemmelse med artikel 2, nr. 3)
g) det samlede fedtindhold som fastsat ved analysemetoden nævnt i artikel 2, nr. 3), litra a)
h) mælkefedtindholdet som fastsat ved en af analysemetoderne nævnt i artikel 2, nr. 3)
i) hvor det er relevant, den fedttype bortset fra mælkefedt, det forarbejdede landbrugsprodukt indeholder.
3. På baggrund af de oplysninger, der modtages fra medlemsstaterne i overensstemmelse med stk. 1 og 2, fremlægger Kommissionen en rapport for medlemsstaterne om virkemåden af proceduren fastlagt i artikel 2, nr. 3), litra c). Kommissionen fremlægger denne rapport senest den 17. juni 2018.
Forordning (EØF) nr. 4154/87 ophæves.
Henvisninger til den ophævede forordning gælder som henvisninger til nærværende forordning og læses efter sammenligningstabellen i bilag V.
Denne forordning træder i kraft på tyvendedagen efter offentliggørelsen i Den Europæiske Unions Tidende.
Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.
BILAG I
Enzymatisk bestemmelse af stivelse og nedbrydningsprodukter, herunder glucose i fødevarer, ved højtryksvæskekromatografi (HPLC)
1. Anvendelsesområde
Metoden tillader bestemmelse af indholdet af stivelse og nedbrydningsprodukter deraf, inkl. glucose i fødevarer til konsum, herefter benævnt »stivelse«. Stivelsesindholdet bestemmes ved kvantitativ analyse af glucose ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) efter enzymatisk nedbrydning af stivelse og nedbrydningsprodukter til glucose.
2. Definition af det samlede glucoseindhold og af det samlede glucoseindhold udtrykt som stivelse
Det samlede glucoseindhold er værdien Z som beregnet i punkt 7.2.1 i dette bilag. Det udtrykker stivelsesindholdet og alle nedbrydningsprodukter, inkl. glucose.
Indholdet af stivelse/glucose som defineret i bilag III til forordning (EF) nr. 1460/96 skal beregnes på basis af det samlede glucoseindhold Z og som beskrevet i artikel 2, nr. 1), i nærværende forordning.
Indholdet af stivelse (eller dekstrin) nævnt i kolonne 3 i bilag IV til Kommissionens forordning (EF) nr. 1043/2005 () skal beregnes på basis af det samlede glucoseindhold Z som beskrevet i artikel 2, nr. 2), punkt 1, i forordning (EF) nr. 904/2008 ().
Stivelsesindholdet nævnt i punkt 1 i dette bilag er værdien E, der beregnes som beskrevet i punkt 7.2.2 i dette bilag. Det udtrykkes i % (m/m). Det svarer til det samlede glucoseindhold Z, der udtrykkes som stivelse. Denne værdi E indgår ikke i ovennævnte beregninger.
3. Princip
Prøverne homogeniseres og opslæmmes i vand. Stivelsen og nedbrydningsprodukter, der er til stede i prøverne, konverteres enzymatisk til glucose i to faser:
Stivelsen og nedbrydningsprodukter konverteres delvist til opløselige glucosekæder ved anvendelse af varmestabil alfa-amylase ved 90 °C. For at opnå en effektiv konvertering er det nødvendigt, at prøverne er helt opløst eller opslæmmet til kun at indeholde meget små faste bestanddele.
De opløselige glucosekæder konverteres til glucose med amyloglucosidase ved 60 °C.
Produkter med et højt indhold af proteiner eller fedtstof klares og filtreres.
Bestemmelsen af sukkerarter foretages ved HPLC-analyse.
Fordi der kan forekomme delvis inversion af saccharose under den enzymatiske behandling, foretages bestemmelsen af frie sukkerarter også ved HPLC-analyse for at beregne det korrigerede glucoseindhold.
4. Reagenser og andre materialer
Alle reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet og vand demineraliseret.
4.1. Glucose, min. 99 %
BILAG II
Bestemmelse af indholdet af stivelse, dextrin eller anden modificeret stivelse indeholdt i varerne henhørende under KN-kode 3505 20 10 til 3505 20 90 samt af stivelse og stivelsesprodukter indeholdt i varerne henhørende under KN-kode 3809 10 10 til 3809 10 90
I. METODENS PRINCIP
Ved syrehydrolyse sønderdeles stivelsen til reducerende sukker, der bestemmes volumetrisk ved hjælp af Fehling-væske.
II. APPARATER OG REAGENSER
Kolbe med et rumindhold på ca. 250 ml
Målekolbe med et rumindhold på 200 ml
Burette med et rumindhold på 25 ml
Saltsyre, vægtfylde 1,19
Kaliumhydroxid i vandig opløsning
Aktivt kul
Fehling-væske
Metylenblåt i 1 pct. vandig opløsning.
III. FORSØGETS GENNEMFØRELSE
I en kolbe rummende ca. 250 ml indvejes så meget mængde prøve, at det svarer til ca. 1 g stivelse, og der tilføjes 100 ml destilleret vand og 2 ml saltsyre. Blandingen koges i tre timer under tilbagesvaling.
Efter afkøling hældes kolbens indhold kvantitativt på en målekolbe rummende 200 ml, og der tilføjes så meget kaliumhydroxid, at opløsningen kun reagerer svagt surt. Derefter fyldes der op med destilleret vand indtil 200 ml, og væsken filtreres gennem aktivt kul for at blive affarvet.
Med denne opløsning fyldes derefter en gradueret burette, og 10 ml Fehling-væske reduceres på følgende måde:
I en stålkolbe rummende ca. 250 ml hældes 10 ml Fehling-væske (5 ml væske A og 5 ml væske B). Kolben rystes, indtil der fremkommer en klar opløsning, og derpå tilføjes 40 ml destilleret vand og lidt kvarts eller pimpsten.
Kolben anbringes på en kvadratisk plade af asbest, der i midten har en cirkelformet åbning med diameter ca. 6 cm. Asbestpladen lægges på et trådnet. Kolben opvarmes nu således, at væsken begynder at koge i løbet af ca. 2 minutter.
Den kogende væske tilsættes derefter så meget af sukkeropløsningen fra buretten, at Fehling-væskens blå farve næsten ikke er synlig. Der tilsættes nu 2-3 dråber metylenblåtopløsning som indikator, og titreringen fortsættes ved yderligere dråbevis tilsætning af sukkeropløsningen, indtil indikatorens blå farve forsvinder.
Med henblik på større nøjagtighed gentages titreringen under samme betingelser, idet dog næsten hele den mængde sukkeropløsning, der kræves til reducering af Fehling-væsken, tilsættes på én gang. Ved denne titrering skal Fehling-væsken være fuldstændig reduceret i løbet af 3 minutter. Fortsæt kogningen i nøjagtig to minutter. Titreringen fortsættes ved yderligere dråbevis tilsætning i det tredje minut, indtil indikatorens blå farve forsvinder.
BILAG III
Påvisning af mel eller gryn af blød hvede i makaroni, spaghetti og lignende varer
(efter Young og Gilles-metoden, ændret af Bernaerts og Grunner)
I. METODENS PRINCIP
Af prøven udvindes med anvendelse af et ikke-polart opløsningsmiddel en ekstrakt.
Ekstrakten kromatograferes på en plade med et tyndt lag af kiselgel. Herved skilles de tilsvarende steroler i forskellige fraktioner af form som striber.
Ud fra antallet af de intensive farvestriber kan man slutte, om produktet kun er fremstillet af hård hvede eller blød hvede eller af en blanding af hård og blød hvede. Endvidere kan det konstateres, om der er anvendt æg til produktets fremstilling.
II. APPARATER OG REAGENSER
Homogenisator eller laboratoriemølle for at kunne fremstille et malet produkt, der kan passere gennem en sigte med maskevidde 0,200 mm.
Standardiseret sigte med en maskevidde af 0,200 mm.
Vakuum-inddampningsapparat med vandbad.
Glasplade, aluminiumfolie eller andre egnede materialer i format 20 × 20 cm påført et tyndt lag kiselgel. Påfører man selv det tynde lag af kiselgel, anvendes en blanding af kiselgel og gips med et indhold af gips på ca. 13 %. Det påføres med et egnet redskab, idet producentens vejledning følges. Det skal være 0,25 mm tykt.
Mikropipette til afmåling af 20 mikroliter.
Kar med låg til fremkaldelse af kromatogrammerne.
Forstøver.
Petroleumsæter med et kogeinterval mellem 40 og 60 °C, redestilleret før brugen.
Diethylæter, vandfri, til analyse.
Carbontetrachlorid, til kromatografi, redestilleret før brugen.
Molybdenphosphorsyre, til analyse.
Ethylalkohol, 94 volumenprocent.
III. FORSØGETS GENNEMFØRELSE
Ca. 20 g af prøven males så fint, at stoffet kan passere helt gennem sigten. Den fint formalede prøve hældes på en Erlenmeyer-kolbe, dækkes med 150 ml petroleumsæter og står til næste dag ved stuetemperatur. Kolben rystes fra tid til anden.
Derefter filtreres blandingen gennem en Büchner-tragt med filtrerlag eller gennem et foldefilter. Det klare filtrat overføres portionsvis til en 100 ml-kolbe, og opløsningsmidlet fordampes under reduceret tryk ved en vandbadstemperatur på 40-50 °C. Efter opløsningsmidlets fordampning fortsættes opvarmningen i endnu 10 minutter under reduceret tryk.
BILAG IV
Ophævet forordning med ændring
| Kommissionens forordning (EØF) nr. 4154/87 | (EFT L 392 af 31.12.1987, s. 19) |
|---|---|
| Kommissionens forordning (EF) nr. 203/98 | (EFT L 21 af 28.1.1998, s. 6) |
BILAG V
Sammenligningstabel
| Forordning (EØF) nr. 4154/87 | Nærværende forordning |
|---|---|
| Artikel 1 til 4 | Artikel 1 til 4 |
| Artikel 5 | — |
| — | Artikel 5 |
| Artikel 6 | Artikel 6 |
| Bilag I, II og III | Bilag I, II og III |
| — | Bilag IV |
| — | Bilag V |
() EFT L 256 af 7.9.1987, s. 1.
() EFT L 392 af 31.12.1987, s. 19.
() Se bilag IV.
() EFT L 318 af 20.12.1993, s. 18.
() EUT L 328 af 15.12.2009, s. 10.
() EUT L 138 af 26.5.2011, s. 18.
() EUT L 172 af 5.7.2005, s. 24.
() EUT L 249 af 18.9.2008, s. 9.
4.2. Fructose, min. 99 %
4.3. Saccharose, min. 99 %
4.4. Maltose-monohydrat, min. 99 %
4.5. Lactose-monohydrat, min. 99 %
4.6. Opløsning af varmestabil alfa-amylase (1,4-alfa-D-glucan-glucanohydrolase), med aktivitet på ca. 31 000 U/ml (1U vil frigøre 1,0 mg maltose fra stivelsen på 3 min ved pH 6,9 og 20 °C). Dette enzym kan indeholde en lav mængde urenheder (f.eks. glucose eller saccharose) og andre interfererende enzymer. Lagring ved ca. 4 °C. Alternativt kan andre kilder til alfa-amylase anvendes til at opnå en endelig opløsning med tilsvarende enzymaktivitet.
4.7. Amyloglucosidase (1,4-alfa-D-glucan-glucohydrolase) fra Aspergillus niger, pulver med en aktivitet på ca. 120 U/mg eller ca. 70 U/mg (1U vil frigøre 1 micromol glucose fra stivelsen pr. minut ved en pH på 4,8 og 60 °C). Dette enzym kan indeholde en lav mængde urenheder (f.eks. glucose eller saccharose) og andre interfererende enzymer (f.eks. invertase). Lagring ved ca. 4 °C. Alternativt kan andre kilder til amyloglucosidase anvendes til at opnå en endelig opløsning med tilsvarende enzymaktivitet.
4.8. Zinkacetatdihydrat, p.a.
4.9. Kalimhexacyanoferrat (II) (K4[Fe(CN)]6.3H2O), ekstra rent.
4.10. Natriumacetat, vandfrit, p.a.
4.11. Iseddike, 96 % (v/v) (minimum).
4.12. Natriumacetatbuffer (0,2 mol/l). I et bægerglas afvejes 16,4 g natriumacetat (punkt 4.10). Opløs i vand, og overfør til en 1 000 ml målekolbe. Der fyldes op til mærket med vand, og pH justeres til 4,7 med eddikesyre (brug pH-meter (punkt 5.7)). Denne opløsning er holdbar i op til 6 måneder ved opbevaring ved 4 °C.
4.13. Amyloglucosidaseopløsning. Der fremstilles en opløsning af amyloglucosidasepulver (punkt 4.7) i natriumacetatbuffer (punkt 4.12). Enzymaktiviteten skal være tilstrækkelig og i overensstemmelse med stivelsesindholdet i prøvemængden (f.eks. opnås en aktivitet på ca. 600 U/ml fra 0,5 g amyloglucosidasepulver 120 U/mg (punkt 4.7) i en slutvolumen på 100 ml for 1 g stivelse i prøvemængden). Fremstilles umiddelbart før brug.
4.14. Referenceopløsninger. Der fremstilles opløsninger af glucose, fructose, saccharose, maltose og lactose i vand som dem, der sædvanligvis benyttes ved HPLC-analyse af sukker.
4.15. Klaringsreagens (Carrez I). I et bægerglas opløses 219,5 g zinkacetat (punkt 4.8) i vand. Opløsningen overføres til en 1 000 ml målekolbe, og der tilsættes 30 ml eddikesyre (punkt 4.11). Efter omhyggelig blanding fyldes der op til mærket med vand. Denne opløsning er holdbar i op til seks måneder ved opbevaring ved rumtemperatur. Der kan anvendes andre klaringsreagenser svarende til Carrez-opløsningen.
4.16. Klaringsreagens (Carrez II). I et bægerglas opløses 106,0 g kaliumhexacyanoferrat (II) (punkt 4.9) i vand. Opløsningen overføres til en 1 000 ml målekolbe. Efter omhyggelig blanding fyldes der op til mærket med vand. Denne opløsning er holdbar i op til seks måneder ved opbevaring ved rumtemperatur. Der kan anvendes andre klaringsreagenser svarende til Carrez-opløsningen.
4.17. Mobil fase til HPLC. Der fremstilles en mobil fase som dem, der sædvanligvis benyttes ved HPLC-analyse af sukker. Hvis der f.eks. anvendes en aminopropylsilicagelkolonne, benyttes almindeligvis en blanding af vand af HPLC-kvalitet og acetonitril som mobil fase.
5. Apparatur
5.1. Standardlaboratorieglasudstyr.
5.2. Foldefiltre, f.eks. 185 mm.
5.3. Sprøjtefiltre, 0,45 μm, til vandige opløsninger.
5.4. Prøveglas, der passer til HPLC-autosampleren.
5.5. 100 ml målekolber.
5.6. Injektionssprøjter af plast, 10 ml.
5.7. pH-meter.
5.8. Analysevægt.
5.9. Vandbad med termostat, temperaturinterval 60-90 °C.
5.10. HPLC-apparatur, der er egnet til sukkeranalyse.
6. Metode
6.1. Prøveforberedelse for forskellige produkttyper
Prøverne homogeniseres.
6.2. Prøvemængde
Prøvemængden skønnes ud fra varedeklarationen og betingelserne for HPLC-analyse (glucosereferenceopløsningens koncentration), og må ikke overskride:
Prøven afvejes med en nøjagtighed på 0,1 mg.
6.3. Blindprøve
Der foretages en blindbestemmelse i form af en fuldstændig analyse (som beskrevet i punkt 6.4) uden tilsætning af prøve. Resultatet af blindbestemmelsen bruges ved beregningen af stivelsesindholdet (punkt 7.2).
6.4. Analyse
6.4.1. Prøveforberedelse
Prøven homogeniseres ved rystning eller omrøring. Den valgte prøvemængde (punkt 6.2) afvejes i en målekolbe (punkt 5.5), og der tilsættes ca. 70 ml varmt vand.
Efter opløsning eller opslæmning tilsættes der 50 μl varmestabil alfa-amylase (punkt 4.6), og der opvarmes til 90 °C i 30 min i et vandbad (punkt 5.9). Der afkøles så hurtigt som muligt til 60 °C i et vandbad, og der tilsættes 5 ml amyloglucosidaseopløsning (punkt 4.13). For prøver, der kan påvirke reaktionsopløsningens pH-værdi, kontrolleres pH og om nødvendigt justeres den til 4,6-4,8. Lad blandingen reagere i 60 min ved 60 °C. Lad prøverne køle ned til rumtemperatur.
6.4.2. Klaring
For prøver med et højt indhold af proteiner eller fedtstoffer foretages der klaring ved at tilføje 1 ml Carrez I (punkt 4.15) til prøveopløsningen. Efter omrystning tilføjes 1 ml Carrez II (punkt 4.16). Prøve omrystes igen.
6.4.3. Behandling i forbindelse med HPLC-analyse
Prøven i målekolben fortyndes ved at fylde op til mærket med vand, den homogeniseres og filtreres gennem et foldefilter (punkt 5.2). Prøveekstraktet opsamles.
Ekstrakterne filtreres gennem et sprøjtefilter (punkt 5.3) med en injektionssprøjte (punkt 5.6), der først er skyllet med ekstraktet. Filtratet omsamles i glas (punkt 5.4).
6.5. Kromatografi
HPLC-analysen gennemføres som normalt for sukker. Spor af maltose ved HPLC-analysen kan være tegn på, at stivelsen ikke er fuldstændigt omdannet, hvilket medfører en for lav udskillelse af glucose.
7. Beregning og angivelse af resultater
7.1. Beregning af HPLC-resultater
For beregningen af stivelsesindholdet er det nødvendigt med resultaterne af to HPLC-analyser, nemlig mængden af sukker til stede i prøven før (»frie sukkerarter«) og efter den enzymatiske behandling (som beskrevet i denne metode). Der foretages ligeledes en blindbestemmelse for at kunne korrigere for de sukkerarter, der er til stede i enzymerne.
I HPLC-analysen bestemmes toparealet efter integration, og koncentrationen beregnes efter kalibrering med referenceopløsningerne (punkt 4.14). Koncentrationen af glucose (g/100 ml) i blindprøven fratrækkes glucosekoncentrationen (g/100 ml) efter enzymatisk behandling. Eventuelt beregnes indholdet (g sukker/100 g prøve) af sukkerarter ud fra den vejede prøvemængde, hvilket resulterer i:
— glucose g
— fructose F
— saccharose S
— glucose efter korrektion for blindprøven (Ge cor)
— fructose Fe
— saccharose Se
7.2. Beregning af stivelsesindholdet
7.2.1. Beregning af det samlede glucoseindhold »Z«
Hvis mængden af fructose efter enzymatisk behandling (Fe) er højere end mængden af fructose før enzymatisk behandling (F), konverteres den saccharose, der er til stede i prøven, delvist til fructose og glucose. Dette betyder, at der skal foretages korrektion for den frigjorte glucose (Fe – F).
Z, det endelige glucoseindhold efter korrektion i g/100 g:
Z = (Ge cor) – (Fe – F)
7.2.2. Beregning af det samlede glucoseindhold, der udtrykkes som stivelse
E, »stivelsesindhold« i g/100 g:
E = [(Ge cor) – (Fe – F)] × 0,9
8. Præcision
Resultaterne af en ringtest af præcisionen af den metode, der anvendes for de 2 prøver, er beskrevet i dette punkt. De afspejler de krav for metoden, der er beskrevet i dette bilag.
Resultater af ringtesten (vejledende)
Der er i 2008 udført en ringtest med deltagelse af de europæiske toldmyndigheders laboratorier.
Evalueringen af præcisionsdata blev udført i overensstemmelse med »Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies«, W. Horwitz, (IUPAC teknisk rapport), Pure & Appl. Chem., Vol. 67, nr. 2, s. 331-343, 1995.
Præcisionsdataene er vist i nedenstående tabel.
| Prøveemner 1: 2: | Z prøve 1 | Z prøve 2 |
|---|---|---|
| Antal laboratorier | 41 | 42 |
| Antal laboratorier efter eliminering af laboratorier med afvigende resultater | 38 | 39 |
| Gennemsnit (%, m/m) | 29,8 | 55,0 |
| Standardafvigelse på repeterbarhed, sr (%, m/m) | 0,5 | 0,5 |
| Standardafvigelse på reproducerbarhed, sR (%, m/m) | 1,5 | 2,3 |
| Repeterbarhedsgrænse, r (%, m/m) | 1,4 | 1,4 |
| Reproducerbarhedsgrænse, R (%, m/m) | 4,2 | 6,6 |
Prøvens indhold af stivelse i vægtprocent beregnes efter følgende formel:
Stivelse i procent = ((T × 200 × 100)/(n × p)) × 0,95
hvor:
T = et kvantum vandfri dextrose i g, der svarer til 10 ml Fehling-væske, 10 ml Fehling-væske (5 ml væske A og 5 ml væske B) svarer til 0,04945 g vandfri dextrose, når væske A indeholder 17,636 g kobber pr. liter
n = den ved titreringen forbrugte mængde sukkeropløsning i ml
p = den indvejede mængde prøve
0,95 = faktor til omregning af vandfri dextrose til stivelse.
IV. FREMSTILLING AF FEHLING-VÆSKE
Væske A : I en målekolbe opløses 69,278 g krystalliseret, analyserent, jernfrit kobbersulfat (CuSO4 5H2O) i destilleret vand til 1 liter. Opløsningens nøjagtige indhold af kobber kontrolleres ved en kvantitativ bestemmelse af dette.
Væske B : I en målekolbe opløses 100 g natriumhydroxid og 346 g kaliumnatriumtartrat (Seignettesalt) i destilleret vand til 1 liter.
De to væsker A og B blandes i lige dele umiddelbart før anvendelsen. 10 ml Fehling-væske (5 ml væske A og 5 ml væske B) reduceres fuldstændigt af 0,04945 g vandfri dextrose, når fremgangsmåden er som beskrevet under III.
Efter kolbens afkøling bestemmes vægten af den opnåede ekstrakt. Ekstrakten opløses derefter i diethylæter, idet der for hver 60 mg ekstrakt benyttes 1 ml diethylæter.
Tyndtlagspladerne med kiselgel aktiveres ved opvarmning ved 130 °C i tre timer. Man lader dem afkøle i en ekssikkator over kiselgel. Plader, der ikke straks anvendes, forbliver i ekssikkatoren.
På et så frisk aktiveret lag som muligt påføres 20 mikroliter af den klare opløsning i form af en jævn stribe på 3 cm’s længde, bestående af ved siden af hinanden liggende dråber, hvorpå man lader opløsningsmidlet fordampe.
Kromatogrammet elueres ved stuetemperatur med carbontetrachlorid i et kromatografikar, hvis vægge er dækket med filtrerpapir, der indeholder opløsningsmidlet. Efter ca. en times forløb har opløsningsmidlet nået en højde af 18 cm. Man tager pladen op og lader opløsningsmidlet fordampe i luften. Kromatogrammet elueres derefter en gang til, for at striberne skal blive bedre skilt fra hinanden. Opløsningsmidlet lader man igen fordampe i luften.
Tyndtlagskromatogrammet påsprøjtes nu med en 20 %-opløsning af molybdenphosphorsyre i ethylalkohol. Lagets farve skal være ensartet gul. Ved en derpå følgende 5 minutter lang opvarmning til 110 °C gøres striberne synlige.
IV. AFLÆSNING AF KROMATOGRAMMET
Viser kromatogrammet en eneste kraftig hovedstribe med en Rf-værdi af ca. 0,4 til 0,5, er der ved produktets fremstilling anvendt hård hvede. Er der derimod to hovedstriber af samme intensitet, er det anvendte råstof blød hvede. Blandinger af blød og hård hvede kan erkendes ved at de to striber har forskellig intensitet.
Kan der på kromatogrammet konstateres tre striber (to striber i højde som blød hvedes hovedstriber og en stribe, der ligger derimellem), tyder dette på, at produktet indeholder æg. Er den øverste stribe i dette tilfælde svagere end den mellemliggende stribe, er der anvendt hård hvede som råstof. Er den øverste stribe derimod mere udtalt end den mellemliggende stribe, er der anvendt blød hvede.
